PCR

Een PCR reactie (Polymerase Chain Reactie) is een methode om zeer kleine hoeveelheden van enkele specifieke stukjes DNA te vermeerderen tot er genoeg is om deze te kunnen analyseren. De PCR reactie maakt gebruik van het feit dat het DNA is opgebouwd uit een dubbele helix: er zitten dus twee complementaire DNA strengen aan elkaar vast (de nucleotides A tegenover T en C tegenover G) In het figuur aan de rechterzijde van de pagina is de PCR reactie schematisch weergegeven. De reactie bestaat uit drie stappen.

• Denaturatie (Denaturation): door het verhogen van de temperatuur (tot 90 a 96 °C) valt het dubbelstrengs DNA uit elkaar en krijg je enkelstrengs DNA.
• Hybridisatie (Annealing): door het verlagen van de temperatuur naar een temperatuur tussen de 45 en 60°C kunnen de primers (markers), kleine stukjes DNA die zich specifiek op een bepaalde DNA-code richten hechten aan het enkelstrengs DNA. Doordat de primers bestaan uit korte stukjes bewegen deze veel sneller in de oplossing dan het grote logge enkelstrengs DNA. Hierdoor heeft het enkelstrengs DNA niet genoeg tijd om de denaturatie ongedaan te maken maar hebben de primers wel genoeg tijd om te hechten.
• Extensie (Elongation): het polymerase eiwit verlengt bij een gemiddeld hoge temperatuur het stuk DNA tussen de gebonden primers in. Na deze cyclus bevat de oplossing twee keer zoveel van het gewenste DNA (het stuk tussen de primers!) dan daarvoor. Het overige DNA vermeerderd zich niet. Door deze cyclus te herhalen (ongeveer 30 keer) groeit het gewenste DNA exponentieel. Doordat het andere in de oplossing aanwezige DNA niet wordt vermeerderd is dit in het eindproduct te verwaarlozen.

Primers
Een primer is een klein stukje enkelstrengs DNA of RNA dat gebruikt wordt als startpunt voor de PCR reactie. Er zijn altijd twee primers nodig, eentje die vanaf de 5’ kant vermeerdert en eentje die vanaf de 3’ kant vermeerdert. Het tussenliggende stuk DNA is dan het stuk dat vermeerderd wordt in de reactie. Een goede primer is niet te kort omdat de primer dan minder specifiek is (hoe korter de primer, hoe groter de kans dat de DNA-code ook bij andere soorten voorkomt!). Een goede primer is ook niet te lang omdat deze dan secundaire structuren kan vormen waardoor de PCR reactie niet meer effectief is.

Voor environmental DNA is het van belang dat de primers lang genoeg zijn om er zeker van te zijn dat ze enkel hechten aan DNA van de doelsoort. Daarnaast zijn goede primers niet te lang omdat er gewerkt wordt met kleine stukjes vaak al uit elkaar gevallen DNA. Te lange primers zijn dan minder efficiënt om dat ze niet aan de korte fragmenten binden wat de trefkans van de methode verlaagd.